IDRE
 
 

Eseménynaptár

Szeptember 2010
V H K Sz Cs P Sz
      1 2 3 4
5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 23 24 25
26 27 28 29 30    
Teljes Nézet

Bejelentkezés





Elfelejtette a jelszavát?
Sep. 5 - 'Díszmadár és kisállatbörze' - Győr, Állatkert mellett - Győr,

Sep. 5 - 'Börze' - Szentes, Móricz Zsigmond Művelődési Ház - Szentes,

Sep. 11 - 'Díszmadár és kisállatbörze' - Ópusztaszer, Találkozások Tere - Ópusztaszer,

Sep. 12 - 'Börze' - Monor, Vásártér - Monor,

Sep. 12 - 'Kisállatvásár' - Csorna, Euronics áruház udvara - Csorna,

Sep. 17 - 'Kiállítás' - Tiszafüred, Kovács Pál Művelődési Központ - Tiszafüred ,

Sep. 18 - 'Kiállítás' - Tiszafüred, Kovács Pál Művelődési Központ - Tiszafüred ,

Sep. 19 - 'Kisállat börze' - Szolnok, Lengyelpiac - Szolnok,

Sep. 19 - 'Díszmadár és kisállatbörze' - Szombathely, Savaria Ifjúsági Centrum - Szombathely,

Sep. 19 - 'Kiállítás' - Tiszafüred, Kovács Pál Művelődési Központ - Tiszafüred ,

eXTReMe Tracker
Add to Technorati Favorites
 
 
Főlap arrow Oktatás arrow Géntechnológia
Géntechnológia
Írta: Ismeretlen   
2007.01.27 [13:39]

Géntechnológia

   Mióta felfedezték, hogy az élő szervezetben az információ DNS molekulák formájában tárolódik, azóta foglalkoztatja a kutatókat a gondolat, hogy az információ megváltoztatásával módosítani lehetne a sejtnek vagy akár egy teljes élő szervezetnek bizonyos tulajdonságait, működését. Később az is bebizonyosodott, hogy egyes betegségek a genetikai információ sérüléséből erednek, ezért a kutatásnak az is lökést adott, hogy esetleg ezeket ilyen módon lehetne gyógyítani. Manapság a nagy „sztár”, a „human genome project” is jelentősen hozzájárul ahhoz (pénzügyileg is), hogy ezen a területen kutatások folyhassanak.
   A DNS szekvenciáját rutinszerűen az 1970-es években kezdték módosítani. A géntechnika azóta is a biokémia-bioinformatika folyamatosan fejlődő ága, nem utolsósorban annak köszönhetően, hogy a technika fejlődésével egyre kisebb dolgokkal vagyunk képesek dolgozni és még annál is kisebb dolgokat tudunk megfigyelni.

DNS hibridizáció

   Minél jobban illeszkedik egymáshoz (komplementer bázisok egymással szemben) két egyszálú DNS molekula, annál inkább képesek arra, hogy együtt 1 db kétszálú molekulát alkossanak. (Minél több hidrogénkötés tud létrejönni, annál stabilabb az új molekula.) Ilyen kétszálú molekulák létrejöhetnek két DNS szálból vagy egy DNS és egy RNS szálból is (ez esetben nem fog a szabályos helix szerkezet kialakulni).
A gyakorlatban a hibridizációs kísérletek úgy néznek ki, hogy a vizsgálni kívánt molekulákat egy oldatban felmelegítik, hogy a kettős szálak szétessenek egyesekre. Ezután az oldat lassú hűtése közben mérik, hogy a molekulák mekkora hányada alkot duplaszálat (ezeket hidroxiapatittal meg lehet kötni). Ezt az idő függvényében vizsgálva információt lehet kapni pl. arról, hogy a vizsgált DNS-állomány mekkora hányada volt ismétlődő ill. egyéni szekvencia.
   Az alapkísérletet sokféleképpen lehet módosítani, pl: az oldatba radioaktívan jelölt templátokat keverve kimutatható bizonyos szekvenciák jelenléte.

Restrikciós enzimek

   A rekombináns DNS technikák alapja az, hogy egy DNS szálat (illetve duplaszálat) valahol elhasítunk, a vágáshoz hozzáragasztunk egy új, általunk szintetizált vagy máshonnan kivett, ismert szekvenciájú részt, esetleg ehhez az új részhez még visszaragasztjuk az eredeti szál folytatását. Az így kapott molekulát be kell ültetni egy gazdasejtbe, ami azt sokszorosítja és szintetizálja róla a megfelelő fehérjéket.
   Az első lépéshez a kulcs a restrikciós endonukleázok. Ezek olyan enzimek, amelyek egy DNS szálat egy bizonyos szekvenciánál képesek elhasítani. Mint sok más enzimet, ezt is az E. Coli baktériumban fedezték fel. Azt a célt szolgálja, hogy a sejtbe bekerülő idegen DNS-t (pl. vírusét) elhasítsa, és így működésképtelenné tegye. A saját DNS-ét úgy védi, hogy vannak más enzimei, amelyek a DNS lánc bizonyos helyeit metilálják, így az endonukleáz nem képes odakötődni és hasítani. De a bakteriofágoknak is kialakultak olyan mutánsai, amelyek ezt „tudják”, és nekik is vannak ilyen metilcsoportjaik. A metilációs mintázat baktérium­törzsenként más és más lehet, és persze a fágok is viszik tovább ezt a mintázatot. Ezért előfordul olyan, hogy pl. az egyik törzsön szaporodott bakteriofágok (vírusok) csak azt a törzset képesek hatékonyan fertőzni, amelyen szaporodtak, másikat nem. (Ez vezetett el a restrikciós enzimek felfedezéséhez.)
   Általánosságban az mondható el a restrikciós enzimekről, hogy egy 4-8 bázispár hosszúságú szekvenciát felismernek, és ott elhasítják a DNS szálat. A szekvencia általában palindrom, azaz 180°-os forgatási szimmetriája van. (Az enzimeket a következő konvencióval jelölik: 3 betűs baktérium-rövídítés, esetleg még egy betű és egy római szám.) A különböző szervezetekből kb. 100 fajta enzimet sikerült izolálni és meghatározni, hogy milyen szekvenciánál működnek.

DNS szekvenálás, szintézis, sokszorosítás

   A restrikciós enzimek egy lehetséges alkalmazása az ún. restrikciós térképek készítése, ami (főleg régebben) arra jó, hogy DNS-ek „ujjlenyomatait” készítsük el, vagy kissé különböző DNS szálakat hasonlíthassunk össze. A módszer a következő: a DNS preparátumot összekeverjük egy ilyen enzimmel. Ez hasít bizonyos helyeken, a hosszú szálakból rövidebbek lesznek. Ezután másik enzimet keverünk hozzá, ami más helyeken fog hasítani. Az eljárást lehet még folytatni több enzimmel is. Végül a keletkezett fragmenteket gél elektroforézis útján szétválogatjuk méret szerint. A kapott mintázat jellemző lesz az adott génre vagy DNS-szakaszra. A módszer a gél típusától függően 1000- 20000 bázispár hosszú fragmentek szétválogatását teszi lehetővé. (1. ábra)

   Ha azt akarjuk megtudni, hogy egy bizonyos szekvencia előfordul-e egy DNS molekulában, akkor a fenti módszer után még denaturálni kell a fragmenteket, hogy egyszálú láncokat kapjunk, majd a keresett szekvencia komplementerével összekeverni. Ez a lánc azzal a lánccal fog hibridizálódni, amelyik a párja, és ha izotóppal volt jelölve (pl. 32-es foszforral), akkor meg lehet találni, hogy az ilyen szekvenciájú fragmentek a gélnek mely pontján gyűltek össze (Southern blotting). Ha az összes vonal szekvenciáját sikerül meghatározni, akkor a restrikciós enzimek ismeretében meg lehet határozni az eredeti molekula szekvenciáját.
   A szekvenálásra egy másik lehetőség, hogy keresünk olyan kémiai reakciókat, amelyek a DNS-láncokat csak az egyik fajta nukleotidnál hasítják. Ha pontosan ugyanolyan láncaink vannak (ez restrikciós endonukleázokkal elérhető), és úgy állítjuk be a körülményeket, hogy minden lánc csak egyszer hasadjon, és a láncok egyik vége jelölve van, akkor meg lehet csinálni a következőt: a DNS-preparátumot négy részre osztjuk, és mindegyiken elvégezzük a különböző nukleotid-specifikus reakciókat. Kedvező esetben így mindenfajta hosszúságú fragment létrejön. Ezután elektroforézissel szétválogatjuk őket, a csíkok helyéből egyszerűen leolvasható, hogy melyik helyen milyen bázis volt. (Gyakorlatilag az eljárás úgy megy, hogy olyan reakciók vannak ami G-nél, A-nál és G-nél, C-nél, C-nél és T-nél hasít, de a módszer ettől még ugyanúgy alkalmazható.) (2. ábra)

   Végül az egyik legfontosabb szekvenálási elv az ún. stop­nukleotid- vagy dideoxi-módszer. Azért fontos, mert e módszer alapján lehet készíteni teljesen automata szekvenáló gépeket. A DNS-t denaturálni kell, valamint a komplementer szál kezdeteként kell egy primer oligonukleotid szál is. A templáton a primer száltól kezdve a DNSpolimerázI enzim segítségével elkezdődik a komplementer szál szintézise. A szintézis akkor tud folyni, ha az oldatba kellő mennyiségű nukleotid is jelen van. Ha azonban a nukleotidok mellett módosított nukleotidok is jelen vannak, melyeknek a ribózáról a 2' és a 3' helyekről is hiányzik az oxigén (dideoxi), akkor az enzim ugyan ezt nem veszi észre és beépíti, de a szál megszakad, nem lehet tovább folytatni. Az előző módszerhez hasonlóan itt is négy ág szükséges, mindben különböző A/T/G/C stop-nukleotidokkal (kb. 1%-ban) és sok rendes nukleotiddal mindegyik fajtából. Kell még ezen kívül megfelelő mennyiségű a templát DNS-ből, valamint a primer szálból. Ez utóbbit jelölni is kell, radioaktívan vagy fluoreszcens anyaggal. Fluoreszcens anyag használata esetén meg lehet csinálni, hogy a négy „edénybe” különböző színen fluoreszkáló anyaggal jelölt primert teszünk. A reakciók eredményeként az edényekben létrejönnek a templát szál különböző hosszúságú komplementer darabjai. Denaturálás után a négy oldatot összekeverjük, elektroforézissel átáramoltatjuk a gélen, és az oszlop alján mérjük a fluoreszcenciát. Így a kapott szín alapján direkt információt kapunk arról, hogy az adott helyen (adott hosszúságú szál pontosan egy pozíciót jelöl ki) milyen bázis volt.
   Mint láthatjuk, e módszert már viszonylag könnyű automatizálni, a legnagyobb probléma az, hogy álljon rendelkezésre a megfelelő szekvenciájú primer oligonukleotid és elegendő másolat a templátból. (3. ábra)

   Az előbbire a megoldás, ha tudunk DNS-t direkt szintetizálni. Ez elsőre bonyolultnak látszik, mert ha összekeverjük a monomereket és polimerizáljuk, akkor mindenféle véletlen kapcsolódási sorrend létre fog jönni. Ehelyett a következő a módszer: a monomerek 5' végét blokkoljuk egy dimetoxitritil (DMT) nevű vegyülettel, a 3' végét pedig aktiváljuk (protonált foszforamidit). A bázisokat és a foszfátokat szintén „védősapkával” látjuk el. Az első monomert kovalensen hozzákötjük egy szilárd anyaghoz. Ehhez hozzáadjuk az első aktivált és DMT-vel levédett monomert, ami hozzá fog kötődni az üveglapon levő monomerhez. Az oldatot lemossuk, és egy másik oldattal eltávolítjuk a védő DMT-t. Ezt is lemossuk, és jöhet a következő monomer. Ez így folytatódhat addig, amíg el nem érjük a kívánt szekvenciát (legfeljebb kb. 100 bázis hosszúságig). A végén (tiofenollal) leválasztjuk a foszfátokat védő metilcsoportokat, leválasztjuk a molekulákat az üveglapról, és levesszük a bázisokat védő csoportokat is. Mivel a hatékonyság nem 100%-os, most még ki kell választani kromatográffal vagy gél elektroforézissel a leghosszabb láncot, ez fogja tartalmazni a célszekvenciát. (4. ábra)

   A templát DNS sokszorosítására is van egy nagyon hatékony eljárás: a PCR (Polymerase Chain Reaction). A kezdetben duplaszálú templát preparátumot felmelegítjük 95 °C-ra, azaz denaturáljuk. Hozzáadunk két fajta oligonukleotidot, olyanokat, amelyek megfelelnek egy-egy helynek a két DNS-szálon, majd az egészet lehűtjük 37 °C-ra. Ekkor a DNS szálak összekapcsolódnak az oligonukleotidokkal,  mert nagyobb valószínűséggel tudják ezt megtenni, minthogy újra egymáshoz kapcsolódjanak. Az oldatba ekkor DNSpolimerázI-et teszünk, ami a primertől kezdve megcsinálja a komplementer szálat (ha vannak nukleotidok az oldatban). Ezután újra denaturálunk, majd lehűtünk, tehát a primerek megint hozzá tudnak kapcsolódni az eredeti, illetve a frissen másolt molekulákhoz. (5. ábra) A most lejátszódó polimerizáció eredményeként már lesz 2 olyan szál, aminek mindkét végén az általunk berakott oligonukleotidok lesznek, és ezeknek a száma innentől kezdve ciklusonként exponenciálisan nő. Kis technikai nehézség, hogy rendesen az enzim tönkremenne 95 °C-on. De ha olyan enzimet használunk, amit pl. a Thermo aquaticus nevű mikrobából izoláltak (ez 70°C-on, gejzírek vizében szeret élni), akkor ez kibírja ezt a magas hőmérsékletet is. A folyamat eredménye: nagy mennyiségű, ismert hosszúságú (akár több 1000 bázis), pontosan definiált végződésű, azonos DNS-fragment.

Rekombináns DNS molekulák előállítása

   A genetikai információ módosításának feltételei most már megvannak. Elsőként a baktériumok plazmidjaiba építettek be idegen DNS-t (A plazmidok rövid, 2000-15000 bázispár hosszúságú DNS-gyűrűk, amelyek pl. az antibiotikum-rezisztencia géneket tartalmazzák, és amelyek kromoszómától függetlenül másolódnak, és akár 200 példányban is jelen lehetnek egy baktériumban.) Ennek módja az, hogy a DNS-t restrikciós enzimmel elhasítják, és a „lyukba” betoldják az idegen DNS-darabot. (6. ábra) Ezután a plazmidot be kell juttatni egy gazdasejtbe. Ez például úgy lehetséges, hogy a baktériumokat hideg, kalcium tartalmú oldatban tartják, majd hirtelen felmelegítik 42 °C-ra. Ennek hatására kb. minden egymilliomodik baktérium fel tud venni egy kezelt plazmidot. Mivel ez elég kevés, ki kell választani, hogy melyek vették fel: ha úgy építettük be az idegen DNS-t, hogy közben az eredetileg ott levő rezisztencia gén ne sérüljön, akkor antibiotikumos táptalajon tenyésztve azok a baktériumok fognak megmaradni, amelyek felvették a plazmidot. A beépített gén ezután a plazmid teljes DNS-állományával együtt fog másolódni, és egy idő után sok példányban fog rendelkezésre állni.
   A másik, nagyobb hatásfokú lehetőség, hogy egy vírust, azaz pl. E. Coli esetén a ë­fágot használjuk a DNS bejuttatására. Egyik variáció, hogy a vírus DNS-ét módosítjuk a következőképpen: van olyan fág mutáns, amit az EcoRI enzim a szokásos 5 helyett csak 2 helyen hasít, így a vírus DNS 3 darabra esik szét. Szétválasztjuk a 3 darabot (centrifuga, elektroforézis), és az általunk beültetni kívánt DNS-darabot olyan végekkel látjuk el, amilyenek a középső darab végei. Összekeverjük az 1. és 3., valamint a mi DNS-darabunkat (aminek maximális hossza 15000 bázispár lehet), így létre fog jönni olyan szál, amiben az eredeti vírus genomnak csak az első és utolsó része van meg, de szerencsére ez túl rövid ahhoz, hogy a fehérjeburokba betokozódhasson. Viszont azok a szálak, amelyeknek a közepén ott van a kicserélt darab, majdnem olyan hosszú lesz, mint az eredeti, így be tud tokozódni. Így a számunkra megfelelő vírusok automatikusan kiválasztódnak. A baktériumok megfertőzése után a Colik az általunk beültetett DNS-t fogják termelni nagy mennyiségben. A másik variáció, hogy a teljes vírus genomot (50000 bázispár) kicseréljük, de ekkor nem lesz fehérjeburok. Ezért kell egy második, egy „helper” vagy „cosmid” fág, aminek ez a célja, hogy fehérjeburkot termeljen, amibe a kicserélt vírusgenom be tud kerülni.
   Ebbe az 50000 bázispárba már sok minden belefér, például meg lehet azt csinálni, hogy egy élőlény, mondjuk az ember genomját restrikciós enzimekkel feldaraboljuk ilyen hosszúságú egységekre, és a vírusok segítségével legyártatunk belőlük sok másolatot. Így létrejön egy génkönyvtár, amiben például lehet keresni is: a fágok keverékének híg oldatával (amelyek most sokfajta idegen gént hordoznak) megfertőzünk egy baktériumtelepet. Mindenhol, ahol egy fág megtelepedett és elkezdte pusztítani a baktériumokat, egy folt keletkezik, ahol az elpusztult baktériumokból kiszabadult DNS-szálak is megtalálhatók lesznek. Erre az egészre ráteszünk egy nitrocellulóz filmet, így a DNS-ek egy része át fog tapadni ide. A filmről sóoldattal eltávolítjuk az esetleg odakerült ép baktériumokat és közben denaturáljuk a DNS-szálakat. Ezután rátesszük azt a preparátumot, amiben a keresni kívánt és szintén denaturált és 32P-vel jelölt RNS vagy DNS van; ezek csak a filmnek arra a részére fognak odatapadni, ahol az ő komplementer DNS-ük van. Most meg kell nézni, hogy a film hol radioaktív, kikeresni az eredeti baktériumtenyészetből azt a foltot, ahonnan az itt levő DNS származik, restrikciós enzimmel kiszedni a középső darabját, és már meg is van a keresett gén.
   Amire ezt használni lehet, az például a génexpresszió nyomon követése. Ha meg akarjuk tudni, hogy egy sejtből kivett mRNS (ami hosszban kb. megfelel annak a fehérjének, aminek eredetét ki akarjuk nyomozni) a genom mely részéből származhatott, akkor ezt az RNS-molekulát felhasználhatjuk a fenti módszerben a hibridizáláshoz. Vagy reverz transzkriptáz enzimek segítségével csinálhatunk egy cDNS molekulát belőle, ami még jobban megfelel a célnak. Azt is megtehetjük, hogy ha a fehérjének ismert az aminosav szekvenciája, akkor azt visszafordítjuk nukleotid-triplet kódra, és ez alapján szintetizálunk egy rövidebb DNS-szakaszt (Néhány 10 bázispár már elég lehet.) A probléma itt az, hogy a legtöbb aminosavat több kódon kódolja, így többfajta DNS-t kell szintetizálni, illetve a fehérjének olyan szakaszát kell megkeresni, ahol lehetőleg csak olyan aminosavak vannak, amelyeket csak 1 kódon ír le.

Idegen gének expresszálása

   Fontos alkalmazása a rekombináns géntechnikának az, hogy lehet például emberi fehérjéket termeltetni baktériumokkal. Az eljárás a következő: a fenti módszerek valamelyikével idegen géneket juttatunk be pl. a Coliba. Az idegen gént most úgy készítjük elő, hogy az mRNS molekulából reverz transzkiptáz segítségével cDNS-t készítünk, mert a baktérium nem rendelkezik azzal az apparátussal, ami képes lenne kezelni az eukariota genomban megtalálható intronokat és exonokat. A cDNS elé beépítünk még prokariota riboszómakötő szekvenciát és egy erős prokariota promotert (vagy olyan helyre tesszük a vektorba, ahol ezek eleve adva vannak). Így a baktérium a saját fehérjéi helyett, illetve mellett ezt a fehérjét fogja gyártani. Hátra van még a kiválasztás, hogy mely baktériumokat sikerült transzformálni: az előző módon filmre „lenyomatot” csinálunk a telepből, a filmre a termelni kívánt fehérjére jellemző, radioaktívan jelölt (pl. 125I) antitesteket teszünk. Ahol a film radioaktív lesz, azok a baktériumok termelik a fehérjét.
   A prokariota sejt hátránya, hogy bizonyos fehérjék termeléséhez szükség van a riboszómákon kívül más fehérjékre (chaperonokra), enzimekre is, amik nélkül a fehérje natív formában nem jöhet létre. Ezért kidolgoztak olyan módszert, aminek segítségével eukariota sejttel, pl. élesztővel lehet idegen fehérjét termeltetni.
   Egyik ilyen lehetőség, hogy az élesztő 5 kromoszómája mellé csinálunk még egy hatodik mesterségeset is. A feltétel csak az, hogy a kromoszómán legyenek meg az élesztőre jellemző telomérek és a centromér. A többi, több 100 ezer bázispár helyre bármit lehet tenni. A kromoszómát rossz hatásfokkal, de be lehet juttatni a sejtbe, és innentől kezdve már az utódokban is meg fog jelenni.
   Másképpen: eukariota vírusok átalakításával a baktériumokhoz hasonló módon lehet idegen gént bejuttatni. Hatékony például a retrovírusok alkalmazása. Ezek RNS-vírusok, amelyek úgy működnek, hogy az RNS bejut a plazmába, ott a gazdasejt reverz transzkriptázával átíródik DNS-é, majd bejutva a sejtmagba, beépül a genomba. Így időnként expresszálódik, és általában nem is pusztítja el a sejtet.
   Az is megoldható, hogy magasabbrendű élőlény (pl. egér) megtermékenyített petesejtjébe juttatunk be idegen gént. Ekkor a DNS-preparátumot mikroszkóp alatt, mikropipettával, direkt módon a sejtmagba kell bejuttatni. (Sokat kell csinálni, mert a sejteknek csak kb. 2%-a lesz működőképes.) Ilyen módszerrel például elő tudtak állítani óriás egeret úgy, hogy patkány növekedési hormon génjét ültették be az egér metallothionein promotere után. Ezt a promotert a nehézfémek aktiválják, így ha az egér pl. kadmiumgazdag táplálékot kapott, akkor sokkal gyorsabban nőtt. Ez jól mutatja, hogy idegen gének milyen hatékonyan tudnak expresszálódni.

Módosított fehérjék előállítása

   Restrikciós enzimekkel viszonylag egyszerű megoldani, hogy egy plazmidból vagy kromoszómából töröljünk egy részt, új darabot tegyünk bele, egy szakaszt megfordítsunk vagy kicseréljünk egy másikra. De ennél még fontosabb, hogy az oligonukleotiddal irányított mutagenezissel pontmutációkat lehet elérni, méghozzá ott, ahol akarjuk. Tehát ha például egy fehérjében egyetlen aminosavat ki szeretnénk cserélni egy másikra, akkor az aminosav környezetének megállapítjuk a DNS szekvenciáját, majd megállapítjuk a kívánt új szekvenciát, amiben már az új aminosavnak megfelelő kodon szerepel, és a fentebb ismertetett módszer segítségével megszintetizáljuk ezt az oligonukleotidot. Az eredeti DNS szálat denaturáljuk, és hozzáhibridizáltatjuk ezt a mesterséges molekulát, mint primert, ha 1 nukleotid nem illeszkedik, attól még – megfelelő hőmérséklet esetén – még a hibridizáció végbemegy. Polimeráz enzim segítségével megcsináljuk a lánc többi részét. A további replikációk során a keletkezett új DNS szálak fele már a módosított szekvenciát fogja tartalmazni, így a sejtjük a módosított fehérjét fogja termelni. Több ilyen beavatkozással elérhető, hogy a fehérjének egy tulajdonságát megváltoztassuk.
   További lehetőségként elérhető az is, hogy több fehérjét, amelyek eredetileg önállóak, összekapcsoljunk. Így például meg lehet csinálni, hogy egy antigént egy enzimmel egybeépítsünk, aminek ilyen módon esetleg gyógyhatása is lehet.

„DNA array”

   A fenti módszerek fontos alkalmazása és továbbfejlesztése még a génexpresszió kutatása és genetikai sérülések, betegségek diagnosztizálása és kezelése. Ennek egyik fontos, és manapság legtöbbet kutatott és legreményteljesebb eszköze a „DNA array”.
   Ennek ugyanaz az alapja, mint a korábban már említett Southern blottingnak és a nitrocellulóz filmem való hibridizációnak: egy egyszálú DNS-hez radioaktív vagy fluoreszcens anyaggal jelölt mRNS-t vagy DNS-t hibridizálunk, és detektáljuk, hogy hova kötődött.
   A továbbfejlődés ezekhez képest több lépcsőben történt: először a baktériumtelepeket (vagyis a „génkönyvtárat”) szabályosan, rácsszerűen rendezték el. Így könnyebb volt visszakeresni a pozíciót, és több gén fért el kisebb helyen. Az igazi áttörés azonban akkor következett be, amikor sikerült a DNS molekulákat nem porózus anyaghoz, hanem pl. üveglaphoz kötni. Ez lehetővé tette a fluoreszcens technikák alkalmazását és a miniatűrizációt: egyetlen mikroszkóp-tárgylemezre kb. 10000 cDNS molekulát lehet felvinni gépi úton. A másik kulcsfontosságú lépés az volt, amikor először állítottak elő olyan array-t, amin 400 ezer különböző, mesterségesen előállított oligonukleotid helyezkedett el. Ezt a félvezetőgyártásból kölcsönzött fotolitográfiai úton sikerült elérni. Vannak próbálkozások arra is, hogy az array-eket a laborban, tintasugaras nyomtatóhoz hasonló szerkezetekkel elő lehessen állítani: a patronból festék helyett nukleotidok kerülnek a lemezre, amik oda kötött láncokhoz kapcsolódnak; ha a pozícionálás elég pontos, akkor pont azt a láncot, amelyiket szeretnénk.
   Tehát a DNS array egy olyan mátrix, amelynek pontjaiban oligonukleotidok, vagy hosszabb, akár teljes fehérjét leíró cDNS molekulák foglalnak helyet. Egy ilyen eszközt fel lehet használni például arra, hogy nyomon követhessük a génexpressziót: hogy a genomnak mely része aktív éppen. Ehhez csak izolálni kell egy sejt mRNS molekuláit, jelöléssel ellátni, és rátenni az array-re. Ahol floureszcencia van, ott meg kell keresni, hogy melyik gén van. Vagy akár nyomon is lehet követni az expresszió változását, és azt is, hogy pl. egy gyógyszer hatására megváltozott-e, és ha igen, akkor hogyan: mely gének kapcsolódtak ki, és melyek be. Ugyanezért ki lehet deríteni vele betegségeket is: könnyű kimutatni vele, ha valamelyik gén nem aktív, pedig annak kellene lennie, vagy fordítva: aktív, pedig passzív kellene, hogy legyen.
   Lehet DNS-variációkat is keresni: ha olyan array-t használunk, amelyikre olyan oligonukleotidokat ültettünk, amelyek csak néhány helyen különböznek egymástól, akkor a vizsgált DNS ahhoz az oligonukleotidhoz fog kapcsolódni a legnagyobb valószínűséggel, amelyik teljesen megfelel az ő szekvenciájának. Ha több ugyanilyen array-t készítünk, és mindegyikre ráteszünk a vizsgált sorozat egy-egy tagjából, akkor a sorozat tagjai közötti eltéréseket akár egyetlen nukleotid pontossággal meg tudjuk állapítani.

Utolsó frissités ( 2007.01.27 [13:40] )
 

Hírlevél

Feliratkozás az IDRE Hírlevelére IDRE Hírlevél



 

  websas.hu Magyar Honlap Linkek Video-DVD-Centrum Toplista